Functional characterization of histone H3.3-glycine 34 mutations in development and cancer

Khazaei, Sima; Khazaei, Sima

Thesis

Functional characterization of histone H3.3-glycine 34 mutations in development and cancer

Public Deposited

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Creator

Khazaei, Sima

Contributors

Nada Jabado (Supervisor)

Abstract

English

Recurrent mutations impacting the glycine 34 codon of H3F3A encoding noncanonical H3 variant H3.3 arise in specific cancers: G34R and rarely G34V mainly occur in high grade gliomas (HGGs) of the cerebral cortex, while G34W characterize 90% of a specific bone cancer, giant cell tumor of the bone (GCTB). There is limited information on H3.3G34-mutant’s oncogenic mechanisms. Using an innovative initial mosaic step approach, we generated direct knock-in (DKI) mice carrying heterozygous germline H3.3 (H3f3a) G34R, V or W mutations. Our data in two different mouse genetic backgrounds consistently show drastically distinct phenotypes between G34R and W mutant mice, while H3.3G34V mice show a similar but milder phenotype to that observed in H3.3G34R DKI mice and no phenotype is observed in mice carrying a deletion of one H3f3a allele. Indeed, severe neurological issues are observed in G34R mutant mice and to a lesser degree in G34V, while minor neurological insults are observed in G34W mice, which in contrast have bladder and uretero-genital issues. All G34 mutant mice exhibit an obesity phenotype, which is most severe in G34W mice. This is consistent with patient data where G34R/V mutations in H3F3A seem exclusive to HGG of the brain while H3.3G34W are specific to mesenchymal tumors namely GCTB. GCTB are characterized by a neoplastic H3.3G34W-mutant stromal population and a bone-resorptive giant osteoclast population. The mechanism by which the H3.3G34W mutation alters the epigenome to give rise to GCTB remains unknown. Here, we generated isogenic cell lines from patient derived GCTB stromal cultures and defined the epigenetic and transcriptomic changes mediated by H3.3G34W. G34W induced H3.3K36me3 loss and H3.3K27me3 gain on mutant H3.3 histones. We show that H3.3G34W promotes H3K27me3 redistribution from intergenic to genic regions. This epigenetic dysregulation and associated transcriptional changes are linked to cell identity, with upregulation of extracellular matrix organization genes and downregulation of contractile actomyosin pathways in H3.3G34W cells. Single-cell transcriptomics of GCTB tumors reveals that G34W stromal cells resemble osteoblast progenitors with distinct populations comprising a neoplastic trajectory from an SPP1+IBSP+ osteoblast-like population towards an ACTA2+ contractile population. Correction of the H3.3G34W mutation by CRISPR-Cas9 in GCTB stromal cells results in increased progression to myogenic differentiation along this trajectory in vitro. We further show that ACTA2+ contractile H3.3G34W stromal cells secrete ligands promoting extracellular matrix remodeling, likely facilitating association and recruitment of osteoclasts. Importantly, orthotopic tibial injection of H3.3G34W, but not isogenic CRISPR-edited stromal cells, resulted in aggressive osteolytic tumors with recruitment of murine multinucleated osteoclasts, indicating a persistent requirement for H3.3G34W mutation in GCTB tumorigenesis

French

Des mutations récurrentes du codon glycine 34 (G34) du gène H3F3A, qui code pour le variant non canonique H3.3 de l’histone H3, sont retrouvés dans certains cancers specifiques. En effet, H3.3G34R et rarement G34V surviennent principalement dans les gliomes de haut grade (HGG) du cortex cérébral, tandis que G34W caractérise 90% d'un cancer des os spécifique, les tumeurs à cellules géantes de l'os (GCTB). La compréhension des mécanismes d’oncogenèse des cancers mutants H3.3G34 est limitée. C’est pourquoi, à l’aide d’une méthode innovante dite « initial mosaic step approach », nous avons généré des souris Knock-In (DKI) portant des mutations germinales hétérozygotes H3.3 (H3f3a) G34R, V ou W. Nos données obtenues dans deux fonds génétiques différents de souris montrent de manière systématique des phénotypes radicalement distincts entre les souris mutantes G34R et W. Les souris H3.3G34V montrent un phénotype similaire mais plus modéré par rapport aux souris H3.3G34R. En revanche, aucun phénotype n'est observé chez les souris portant une délétion d'un allèle H3f3a. En effet, de graves problèmes neurologiques sont observés chez les souris mutantes G34R et à un moindre degré chez les souris G34V, tandis que ces atteintes neurologiques sont mineures chez les souris G34W. Ces dernières présentent en revanche des problèmes de vessie et urétro-génital. Toutes les souris mutantes G34 présentent un phénotype d'obésité, qui est plus sévère chez les souris G34W. L’ensemble de ces résultats est cohérent avec les données de patients où les mutations G34R / V sur le gène H3F3A semblent exclusives aux HGG tandis que la mutation H3.3G34W est spécifique aux tumeurs mésenchymateuses que sont les GCTB. Les GCTB sont caractérisés par une population stromale néoplasique mutante H3.3G34W et une population d'ostéoclastes géants à résorption osseuse. Le mécanisme par lequel la mutation H3.3G34W modifie l'épigénome pour donner naissance aux GCTB reste inconnu. C’est pourquoi nous avons généré des lignées cellulaires isogéniques à partir de cultures stromales de GCTB dérivées de patients et défini les changements épigénétiques et transcriptionnels médiés par la mutation H3.3G34W. Ainsi, nous avons observé que G34W induit une perte de H3.3K36me3 et un gain de H3.3K27me3 sur des histones H3.3 mutantes. Nous montrons également que H3.3G34W favorise la redistribution de H3K27me3 des régions intergéniques vers des régions géniques. Cette dérégulation épigénétique et les changements transcriptionnels associés sont liés à l'identité cellulaire, avec une régulation positive des gènes d'organisation de la matrice extracellulaire et une régulation négative des voies de l'actomyosine contractile dans les cellules H3.3G34W. L’analyse de transcriptomes en cellule unique des tumeurs GCTB révèle que les cellules stromales G34W ressemblent à des progéniteurs d'ostéoblastes avec des populations distinctes comprenant une trajectoire néoplasique d'une population de type ostéoblaste SPP1+ IBSP+ vers une population contractile ACTA2+. La correction de la mutation H3.3G34W par CRISPR-Cas9 dans les cellules stromales de GCTB entraîne une progression accrue vers la différenciation myogénique in vitro. Nous montrons en outre que les cellules stromales contractiles H3.3G34W ACTA2+ sécrètent des ligands favorisant le remodelage de la matrice extracellulaire, facilitant probablement l'association et le recrutement des ostéoclastes. Surtout, l'injection tibiale orthotopique de H3.3G34W, mais pas de cellules stromales isogéniques éditées par CRISPR, a engendré des tumeurs ostéolytiques agressives avec recrutement d'ostéoclastes murins multinucléés. L’ensemble démontre une dépendance persistante à la mutation H3.3G34W du processus de tumorigénèse des GCTB

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